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作者 浙江工業大學生物與環境工程學院 毛 珍,裘娟萍
谷胱甘肽是生物體內一種重要的三肽小分子,具有廣泛的生理功能。對谷胱甘肽在酵母細胞中的作用及其代謝調控機制,做了較為詳細的介紹。這一帶有基礎性研究的內容,對於以酵母為生產菌的谷胱甘肽的生產,或是酵母的其他工業化生產,具有重要的啟示。
谷胱甘肽 ( Glutathione) 是一種在生物體內廣泛存在的活性三肽 ,具有作為藥物、機體異物的解毒劑、機體抗氧化劑、氨基酸運輸物質、輔酶等各種生化作用。近年來谷胱甘肽被用作治療肝病、重金屬中毒、放射線損傷、白內障等的藥物。谷胱甘肽最早是 120 a 前由法國科學家 Rey2pahlade首先從酵母中發現的[1 ]。它在動物組織中的代謝及作用研究一直都非常活躍 ,但專門針對微生物 ,特別是酵母細胞的研究較少 ,而酵母細胞在發酵工業中佔有舉足輕重的地位。因此 ,這一領域的基礎性研究 ,無論是對以酵母為生產菌的谷胱甘肽的生產 ,還是酵母的其它工業化生產 ,都具有重要的啟示意義。1 性質概述 谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸 3 個氨基酸組成 ,化學名為 L2γ2谷氨酰2L2半胱氨酰甘氨酸。它在革蘭氏陰性好氧細菌中含量較高 ,而在革蘭氏陽性和厭氧細菌中幾乎沒有。Fahey[2 ]通過對各種低等微生物中谷胱甘肽含量研究發現 ,惟一一種不含谷胱甘肽的光合細菌是遠古細菌中的嗜鹽菌屬 ,而在藍藻菌和粉色光合細菌中谷胱甘肽的含量已經相當高了。由此推斷它是生物進化過程中 ,作為抵禦氧化壓力的一種物質出現的。谷胱甘肽普遍存在於真核生物中 ,在酵母細胞中其濃度更可高達 10 mmol/ L 。谷胱甘肽能以還原態的 GSH ,氧化態的 GSSG,及一些二硫化合物形式存在 ,如 GSS2COA、GSS2CyS 等。 谷胱甘肽最初是作為生物體內一種高效的抗氧化劑而被關注的。它的氧化還原電位非常低(Eo′=2240 mV) ,可以非常容易地與二硫化物進行巰基交換 ,體內的蛋白質巰基被氧化失活時 ,可以通過谷胱甘肽「解救」出來。谷胱甘肽的還原態由谷胱甘肽還原酶來維繫 ,這一酶依賴 NADPH。谷胱甘肽的 - SH 上的 S 原子上有未共用電子 ,具強親核性 ,可與親電體結合 ,尤其是那些對生物 體而言屬於外源性的化合物 ,所以谷胱甘肽又被喻為生物體內的「清道夫」[3 ]。2 谷胱甘肽的代謝及其代謝調控2. 1 合成與降解 谷胱甘肽在酵母菌中的合成由兩步酶促反應構成 :谷氨酸、半胱氨酸在γ2谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ2GCS) 催化下合成γ2谷氨酰半胱氨酸 ,然後在谷胱甘肽合成酶作用下 ,γ2谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽 ,合成在胞內進行。谷胱甘肽在結構上與其它多肽相比有兩個特點 :不像大多數多肽被多肽酶在 N 端氨基酸的α羧基處分解 ,它的 N 端肽鍵由谷氨酸的γ2羧基和半胱氨酸的氨基構成 ,這一結構保證它不被細胞內一般的蛋白酶水解 ,只能由定位於胞膜上的γ2谷氨酰轉肽酶(γ2GT) 來執行分解。γ2GT 是惟一的谷胱甘肽降解酶[3 ]。γ2GT 調節谷胱甘肽代謝的機制 ,會在 S ,N 代謝中詳細述及。2. 2 GSH1、GSH2 基因的表達調控 酵母中的谷胱甘肽由γ2GCS(γ2谷胺酰半胱氨酸合成酶) 和谷胱甘肽合成酶合成 ,分別由GSH1、GSH2 基因編碼。γ2GCS 是谷胱甘肽合成的關鍵酶 ,它是一個異源二聚體 ,由 2 個不同重量的亞基組成 ,H 亞基 (催化) 和 L 亞基 (調節) ,高水平的 H 亞基能提高谷胱甘肽合成水平。Sugiyama[4 ]等研究發現 ,γ2GCS 的表達是受高度調控的 ,除受終產物谷胱甘肽反饋抑制外 ,還明顯受轉錄水平上的 2 個調節子 Yap1P 和 Skn7P 控制。這 2 個轉錄因子受到環境變化刺激後 ,結合到 GSH1 基因的啟動子上 ,調節γ2GCS 的 2 個亞基的 mRNA 的轉錄 ,進而調節細胞內的谷胱甘肽水平。斯坦福大學的 Gasch 和 Spellman 等[5 ]用DNA 微集陣列 (即 DNA 芯片) ,檢測了酵母的每一個基因受到環境變化刺激後 ,在表達水平上發生的變化 ,也得到了相同的結論。實驗採用的環境變化有 :維生素 K3、過氧化物等活性氧試劑 ;熱衝擊 ;高低滲透壓衝擊 ;氨基酸飢餓等等。結果顯示大約有 900 多個基因對這些變化表現出了相似的激烈反應。其中轉錄因子 Yap1P 高度調控γ2GCS 等基因的表達。 與之相對應 ,谷胱甘肽合成酶是個保守的 ,不受調控的酶。3 谷胱甘肽在酵母中的生理功能3. 1 參與 S, N代謝 釀酒酵母可利用甲硫氨酸、半胱氨酸或谷胱甘肽作為其惟一 S 源。當酵母細胞失去了外源性S 源時 ,谷胱甘肽可作為細胞的 S 源 ,在 S 飢餓時 ,γ2GT 的轉硫途徑受到高度抑制 ,谷胱甘肽的再生量上升[6 ]。而 Mehdi 等[7 ]發現 ,當釀酒酵母受到 N 源飢餓時 ,胞內 90 %以上的谷胱甘肽集中到酵母的中心液泡中 ,N 飢餓中被誘導的γ2GT從高爾基體轉位到液泡膜上 ,催化谷胱甘肽的完全水解 ,釋放出 L2谷氨酸、L2半胱氨酸、甘氨酸到胞質溶液中。這一機制能使飢餓的酵母從谷胱甘肽組成的氨基酸中得到 N 源 ,來滿足生長需要。NH4+抑制γ2GT 的合成。3. 2 幫助酵母菌在甲醇下生長 以甲醇為碳源和能量來源的酵母菌 ,如博伊丁假絲酵母、克勒克酵母和畢赤酵母等 ,在代謝過程中會產生甲醛 ,過量的甲醛對細胞有毒害作用 ,須通過 S2甲酰甲醛脫氫酶系統來清除。該系統用谷胱甘肽作輔助因子。多形漢遜酵母的谷胱甘肽缺陷株由於甲醛在體內積累 ,無法及時清除 ,而不能在甲醇下生長[8 ]。3. 3 對氧化壓力的應答 內外源的活性氧 ,如 H2O2、ROOH、O2・-、- OH・等等 ,會對細胞產生氧化壓力 ,進而導致氧損傷。谷胱甘肽可自發地 ,或在 GPX(谷胱甘肽過氧化物酶) 催化下來清除體內的活性氧( GSH +ROOHGPXGSSG+ ROH + H2O) 。這是谷胱甘肽最重要的生理功能之一。許多研究均表明 ,谷胱甘肽和 GPX 在清除體內氫過氧化物 ,如異丙基苯氫過氧化物、叔2丁基氫過氧化物和內源性的脂類氫過氧化物(LOOH) 方面起重要作用[9 ,10 ]。高水平的谷胱甘肽對高濃度氫過氧化物下菌體的生長尤其重要。谷胱甘肽過氧化物酶受氧化條件誘導 ,它在細胞質膜和線粒體膜中都有存在 ,細胞質膜和線粒體膜正是細胞呼吸產生大量活性氧的地方。Inoue[11 ]從博伊丁假絲酵母中 ,還發現一個由 pmp20 基因編碼的依賴谷胱甘肽的過氧還蛋白。它存在於過氧化物酶體中 ,也是以谷胱甘肽為電子供體 ,作用與 GPX 類似。酵母中另一個抵 御活性氧的系統是硫氧還蛋白 ( TRX) 還原體系 ,它和谷胱甘肽還原體系相輔相成 ,一起組成機體氧化還原緩衝體系[12 ]。Lee 等[13 ]也通過研究發現 ,酵母菌體內與對抗氧化壓力有關的物質的基因有 : GSH1 (γ2GCS) 、GPX2 (谷胱甘肽過氧化物酶) 、GLR (谷胱甘肽還原酶) 、TPX2 (硫氧還蛋白) 、TPP1(硫氧還蛋白還原酶) ,同樣它們的表達都受到 Yap1P , Skn7P 這 2 個轉錄因子的高度調控。3. 4 解毒作用 谷胱甘肽在保護細胞抵禦活性親電物質 (如鹵化的芳香族化合物) 時 ,起重要作用。此類異生素可直接被谷胱甘肽清除掉 ,或通過谷胱甘肽硫轉移酶( GST) 催化( GSH + RXGSTGSX + RH) 形成 GSX ,由轉運蛋白 Ycf1P 轉運至液泡。Jelin2sky[14 ]用烷基化試劑 MMS 實驗顯示 ,釀酒酵母的第 325 個開放閱讀框的轉錄被 MMS 誘導後 ,轉錄水平提高 4 倍 ,其中最強烈的誘導是編碼GST 的 GTT2 基因 ,編碼γ2GT 的 CIS2 基因和編碼質膜 ABC 載體的 PDR10 基因。 谷胱甘肽硫轉移酶 GST 對底物谷胱甘肽有特定的結合位點 ,然後催化谷胱甘肽的 S 與親電物質結合。有些誘導物同時也是此酶的作用底物 ,說明這個誘導是機體的適應反應。GST 廣泛存在於各種生命體中 ,很多化療試劑、殺蟲劑、除草劑、抗生素的抗性都跟 GST 有關。3. 5 抵禦重金屬壓力 谷胱甘肽還能保護酵母細胞免受重金屬壓力。Ortiz ,D. E. 等採用粟酒裂殖酵母、球擬酵母等與鎘鹽接觸 ,發現酵母體內產生 (γ2Glu2Cys) n2Gly(2 仝n仝11) ( Phcs) , 它可與細胞質中的Cd2 +、Cu2 +、Zn2 +等形成螯合物 ,然後由 ABC 載體運輸到液泡中 ,與酸不穩定硫化物結合後沉澱[15 ]。Phcs 這一多肽 ,在某些植物中也有發現。 粟酒裂殖酵母的谷胱甘肽缺陷株不能中和Cd2 +、Cu2 +、Zn2 +,對這些金屬很敏感。4 結 語 酵母菌在自然界中廣泛分佈 ,甚至在許多惡劣的環境下也能生存 ,說明有機體內有一套強大的自我保護及調控機制來應對環境的壓力。谷胱甘肽的主要生理功能 ,如解毒 ,抵禦氧化壓力 ,抵御重金屬壓力等 ,都與這套自我保護機制密切相關。怎樣更好地理解並運用這套自我保護及調控機制 ,對於以酵母為生產菌的工業化生產具有重大的應用價值。
谷胱甘肽是生物體內一種重要的三肽小分子,具有廣泛的生理功能。對谷胱甘肽在酵母細胞中的作用及其代謝調控機制,做了較為詳細的介紹。這一帶有基礎性研究的內容,對於以酵母為生產菌的谷胱甘肽的生產,或是酵母的其他工業化生產,具有重要的啟示。
谷胱甘肽 ( Glutathione) 是一種在生物體內廣泛存在的活性三肽 ,具有作為藥物、機體異物的解毒劑、機體抗氧化劑、氨基酸運輸物質、輔酶等各種生化作用。近年來谷胱甘肽被用作治療肝病、重金屬中毒、放射線損傷、白內障等的藥物。谷胱甘肽最早是 120 a 前由法國科學家 Rey2pahlade首先從酵母中發現的[1 ]。它在動物組織中的代謝及作用研究一直都非常活躍 ,但專門針對微生物 ,特別是酵母細胞的研究較少 ,而酵母細胞在發酵工業中佔有舉足輕重的地位。因此 ,這一領域的基礎性研究 ,無論是對以酵母為生產菌的谷胱甘肽的生產 ,還是酵母的其它工業化生產 ,都具有重要的啟示意義。1 性質概述 谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸 3 個氨基酸組成 ,化學名為 L2γ2谷氨酰2L2半胱氨酰甘氨酸。它在革蘭氏陰性好氧細菌中含量較高 ,而在革蘭氏陽性和厭氧細菌中幾乎沒有。Fahey[2 ]通過對各種低等微生物中谷胱甘肽含量研究發現 ,惟一一種不含谷胱甘肽的光合細菌是遠古細菌中的嗜鹽菌屬 ,而在藍藻菌和粉色光合細菌中谷胱甘肽的含量已經相當高了。由此推斷它是生物進化過程中 ,作為抵禦氧化壓力的一種物質出現的。谷胱甘肽普遍存在於真核生物中 ,在酵母細胞中其濃度更可高達 10 mmol/ L 。谷胱甘肽能以還原態的 GSH ,氧化態的 GSSG,及一些二硫化合物形式存在 ,如 GSS2COA、GSS2CyS 等。 谷胱甘肽最初是作為生物體內一種高效的抗氧化劑而被關注的。它的氧化還原電位非常低(Eo′=2240 mV) ,可以非常容易地與二硫化物進行巰基交換 ,體內的蛋白質巰基被氧化失活時 ,可以通過谷胱甘肽「解救」出來。谷胱甘肽的還原態由谷胱甘肽還原酶來維繫 ,這一酶依賴 NADPH。谷胱甘肽的 - SH 上的 S 原子上有未共用電子 ,具強親核性 ,可與親電體結合 ,尤其是那些對生物 體而言屬於外源性的化合物 ,所以谷胱甘肽又被喻為生物體內的「清道夫」[3 ]。2 谷胱甘肽的代謝及其代謝調控2. 1 合成與降解 谷胱甘肽在酵母菌中的合成由兩步酶促反應構成 :谷氨酸、半胱氨酸在γ2谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ2GCS) 催化下合成γ2谷氨酰半胱氨酸 ,然後在谷胱甘肽合成酶作用下 ,γ2谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽 ,合成在胞內進行。谷胱甘肽在結構上與其它多肽相比有兩個特點 :不像大多數多肽被多肽酶在 N 端氨基酸的α羧基處分解 ,它的 N 端肽鍵由谷氨酸的γ2羧基和半胱氨酸的氨基構成 ,這一結構保證它不被細胞內一般的蛋白酶水解 ,只能由定位於胞膜上的γ2谷氨酰轉肽酶(γ2GT) 來執行分解。γ2GT 是惟一的谷胱甘肽降解酶[3 ]。γ2GT 調節谷胱甘肽代謝的機制 ,會在 S ,N 代謝中詳細述及。2. 2 GSH1、GSH2 基因的表達調控 酵母中的谷胱甘肽由γ2GCS(γ2谷胺酰半胱氨酸合成酶) 和谷胱甘肽合成酶合成 ,分別由GSH1、GSH2 基因編碼。γ2GCS 是谷胱甘肽合成的關鍵酶 ,它是一個異源二聚體 ,由 2 個不同重量的亞基組成 ,H 亞基 (催化) 和 L 亞基 (調節) ,高水平的 H 亞基能提高谷胱甘肽合成水平。Sugiyama[4 ]等研究發現 ,γ2GCS 的表達是受高度調控的 ,除受終產物谷胱甘肽反饋抑制外 ,還明顯受轉錄水平上的 2 個調節子 Yap1P 和 Skn7P 控制。這 2 個轉錄因子受到環境變化刺激後 ,結合到 GSH1 基因的啟動子上 ,調節γ2GCS 的 2 個亞基的 mRNA 的轉錄 ,進而調節細胞內的谷胱甘肽水平。斯坦福大學的 Gasch 和 Spellman 等[5 ]用DNA 微集陣列 (即 DNA 芯片) ,檢測了酵母的每一個基因受到環境變化刺激後 ,在表達水平上發生的變化 ,也得到了相同的結論。實驗採用的環境變化有 :維生素 K3、過氧化物等活性氧試劑 ;熱衝擊 ;高低滲透壓衝擊 ;氨基酸飢餓等等。結果顯示大約有 900 多個基因對這些變化表現出了相似的激烈反應。其中轉錄因子 Yap1P 高度調控γ2GCS 等基因的表達。 與之相對應 ,谷胱甘肽合成酶是個保守的 ,不受調控的酶。3 谷胱甘肽在酵母中的生理功能3. 1 參與 S, N代謝 釀酒酵母可利用甲硫氨酸、半胱氨酸或谷胱甘肽作為其惟一 S 源。當酵母細胞失去了外源性S 源時 ,谷胱甘肽可作為細胞的 S 源 ,在 S 飢餓時 ,γ2GT 的轉硫途徑受到高度抑制 ,谷胱甘肽的再生量上升[6 ]。而 Mehdi 等[7 ]發現 ,當釀酒酵母受到 N 源飢餓時 ,胞內 90 %以上的谷胱甘肽集中到酵母的中心液泡中 ,N 飢餓中被誘導的γ2GT從高爾基體轉位到液泡膜上 ,催化谷胱甘肽的完全水解 ,釋放出 L2谷氨酸、L2半胱氨酸、甘氨酸到胞質溶液中。這一機制能使飢餓的酵母從谷胱甘肽組成的氨基酸中得到 N 源 ,來滿足生長需要。NH4+抑制γ2GT 的合成。3. 2 幫助酵母菌在甲醇下生長 以甲醇為碳源和能量來源的酵母菌 ,如博伊丁假絲酵母、克勒克酵母和畢赤酵母等 ,在代謝過程中會產生甲醛 ,過量的甲醛對細胞有毒害作用 ,須通過 S2甲酰甲醛脫氫酶系統來清除。該系統用谷胱甘肽作輔助因子。多形漢遜酵母的谷胱甘肽缺陷株由於甲醛在體內積累 ,無法及時清除 ,而不能在甲醇下生長[8 ]。3. 3 對氧化壓力的應答 內外源的活性氧 ,如 H2O2、ROOH、O2・-、- OH・等等 ,會對細胞產生氧化壓力 ,進而導致氧損傷。谷胱甘肽可自發地 ,或在 GPX(谷胱甘肽過氧化物酶) 催化下來清除體內的活性氧( GSH +ROOHGPXGSSG+ ROH + H2O) 。這是谷胱甘肽最重要的生理功能之一。許多研究均表明 ,谷胱甘肽和 GPX 在清除體內氫過氧化物 ,如異丙基苯氫過氧化物、叔2丁基氫過氧化物和內源性的脂類氫過氧化物(LOOH) 方面起重要作用[9 ,10 ]。高水平的谷胱甘肽對高濃度氫過氧化物下菌體的生長尤其重要。谷胱甘肽過氧化物酶受氧化條件誘導 ,它在細胞質膜和線粒體膜中都有存在 ,細胞質膜和線粒體膜正是細胞呼吸產生大量活性氧的地方。Inoue[11 ]從博伊丁假絲酵母中 ,還發現一個由 pmp20 基因編碼的依賴谷胱甘肽的過氧還蛋白。它存在於過氧化物酶體中 ,也是以谷胱甘肽為電子供體 ,作用與 GPX 類似。酵母中另一個抵 御活性氧的系統是硫氧還蛋白 ( TRX) 還原體系 ,它和谷胱甘肽還原體系相輔相成 ,一起組成機體氧化還原緩衝體系[12 ]。Lee 等[13 ]也通過研究發現 ,酵母菌體內與對抗氧化壓力有關的物質的基因有 : GSH1 (γ2GCS) 、GPX2 (谷胱甘肽過氧化物酶) 、GLR (谷胱甘肽還原酶) 、TPX2 (硫氧還蛋白) 、TPP1(硫氧還蛋白還原酶) ,同樣它們的表達都受到 Yap1P , Skn7P 這 2 個轉錄因子的高度調控。3. 4 解毒作用 谷胱甘肽在保護細胞抵禦活性親電物質 (如鹵化的芳香族化合物) 時 ,起重要作用。此類異生素可直接被谷胱甘肽清除掉 ,或通過谷胱甘肽硫轉移酶( GST) 催化( GSH + RXGSTGSX + RH) 形成 GSX ,由轉運蛋白 Ycf1P 轉運至液泡。Jelin2sky[14 ]用烷基化試劑 MMS 實驗顯示 ,釀酒酵母的第 325 個開放閱讀框的轉錄被 MMS 誘導後 ,轉錄水平提高 4 倍 ,其中最強烈的誘導是編碼GST 的 GTT2 基因 ,編碼γ2GT 的 CIS2 基因和編碼質膜 ABC 載體的 PDR10 基因。 谷胱甘肽硫轉移酶 GST 對底物谷胱甘肽有特定的結合位點 ,然後催化谷胱甘肽的 S 與親電物質結合。有些誘導物同時也是此酶的作用底物 ,說明這個誘導是機體的適應反應。GST 廣泛存在於各種生命體中 ,很多化療試劑、殺蟲劑、除草劑、抗生素的抗性都跟 GST 有關。3. 5 抵禦重金屬壓力 谷胱甘肽還能保護酵母細胞免受重金屬壓力。Ortiz ,D. E. 等採用粟酒裂殖酵母、球擬酵母等與鎘鹽接觸 ,發現酵母體內產生 (γ2Glu2Cys) n2Gly(2 仝n仝11) ( Phcs) , 它可與細胞質中的Cd2 +、Cu2 +、Zn2 +等形成螯合物 ,然後由 ABC 載體運輸到液泡中 ,與酸不穩定硫化物結合後沉澱[15 ]。Phcs 這一多肽 ,在某些植物中也有發現。 粟酒裂殖酵母的谷胱甘肽缺陷株不能中和Cd2 +、Cu2 +、Zn2 +,對這些金屬很敏感。4 結 語 酵母菌在自然界中廣泛分佈 ,甚至在許多惡劣的環境下也能生存 ,說明有機體內有一套強大的自我保護及調控機制來應對環境的壓力。谷胱甘肽的主要生理功能 ,如解毒 ,抵禦氧化壓力 ,抵御重金屬壓力等 ,都與這套自我保護機制密切相關。怎樣更好地理解並運用這套自我保護及調控機制 ,對於以酵母為生產菌的工業化生產具有重大的應用價值。
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