對環境友善安全的微生物殺蟲劑—蘇力菌

一、前言

　　今年春夏之交，SARS嚴重流行；其後又盛傳台灣發生三十八年來第一個瘧疾本土病例，其實去（2002）年高屏地區爆發流行的登革熱亦甚嚴重，確定病例5336人，其中出血登革熱242病例，死亡21人。疫病流行，各單位緊急噴灑藥劑防治；SARS流行噴灑了許多漂白水，瘧疾、登革熱病媒防治更噴了不少化學殺蟲劑。這些藥劑過度撒布到環境裡，有可能造成一些負面影響。即使是一向被認為對環境低毒、安全之合成除蟲菊精殺蟲劑-百滅寧，近年來亦被列入環境荷爾蒙名單內。因此環保人士、有識之士，莫不對化學藥劑敬而遠之。
　　其實自然界常一物剋一物，各種病菌、病媒亦均有其天敵，吾人可善加篩選、培育作為生物防治之用，微生物殺蟲劑即為一例；最有名的當推蘇力菌（Bacillus thuringiensis,），尤其是其以色列變種（亞種）之用於登革熱病媒幼蟲孑孓防治，曾被廣為推廣。

二、蘇力菌

　　科學家從自然界篩選出1,850多種的微生物或其代謝產物供為害蟲防治之用。包括一百多種的細菌、七百種以上的病毒、750種的真菌以及至少三百種的原生動物。但美國環保署僅核准16種供商業化推廣使用。
　　細菌類的微生物殺蟲劑，主要多為桿狀的桿菌屬（Bacillus）以及Enterobacteriaceae科、Micrococcaceae科、 Pseudomonadaceae科以及Bacillaceae科。約有１００種的細菌會為害昆蟲，其中有四種研究較為詳盡徹底，被廣泛用為害蟲防治，即 Bacillus thuringiensis、B.popilliae、B.lentimorbus、B.sphaericus。其主要特性為具專一性，寄主範圍狹窄，對非標的生物（人及害蟲天敵）無毒、無害。
　　細菌為最早商業化的微生物殺蟲劑。早在1948年一種稱為Doom的乳狀孢子菌，用來防治日本金龜子幼蟲，其內即含有兩種桿菌（Bacillus lentimorbus, B. popilliae），一直延用至今。其次為蘇力菌（Bacillus thuringiensis）kurstaki變種（BTK）用來防治毛毛蟲。其後，又發現許多的蘇力菌品系，並製成各種劑型，以防治各種不同的害蟲。最近更發現有B. sphaericus，亦正開發進行商業化。
　　上述四種桿菌，常呈孢子狀態存在於土壤中。孢子為細菌繁殖型，可以忍受一段時間的紫外線照射、耐乾燥、以及其他的惡劣環境。B. thuringiensis. B.popilliae 還可以從芽胞細胞內代謝產生蛋白質結晶。此結晶對害蟲具毒性，為製成微生物殺蟲劑的主要成份。
　　蘇力菌為深具商業應用價值之微生物殺蟲劑，可以使多種害蟲致病。此菌早在1911年由德國人Thuringia在地中海粉螟蛾幼蟲發現，並予以命名，現在至少可以鑑定出35種變種，各攻擊不同種的害蟲。其孢子內能產生毒蛋白結晶。
　　蘇力菌依美國伊里諾大學昆蟲學家Rick稱：商業上生產蘇力菌，係運用一大型發酵槽發酵，當桿菌在最適環境下分裂增殖，每一細胞內部各產生一個孢子，以及結晶之毒蛋白稱之「內毒素（endotoxin）」。Ozkan等（2000）培養Bti Cry11Aa及Cry4Ba品系以（NH4）2HPO4作為氮源，Bti產量最高。
　　一般市售的蘇力菌商業產品多含有孢子及毒蛋白，但也有只具毒蛋白者。各個蘇力菌亞種或變種所產生之「毒蛋白」，其「蛋白內毒素」各異。此種毒蛋白具專一性，使得蘇力菌產品，各有其不同的害蟲防治對象，而不會傷害到其他生物。
　　1958年，美國第一個上市的蘇力菌為kurstaki變種，稱之BTK，只能用來防治鱗翅目（蝴蝶、蛾類）的幼蟲。1980年代美國環保署許可數種BTK品系，可以防治鱗翅目以外的害蟲，其中包括以色列變種（B. thuringiensis israelensis, Bti）,可以殺死雙翅目某些種蚊子、黑蚋、蕈蚋之幼蟲。

(一)	蘇力菌之性狀：蘇力菌產品呈褐色或單寧色粉末、或橘紅色顆粒，含有孢子、毒蛋白以及一些不活性物質。蘇力菌製劑，市售產品為能動之菌體，每公克約2.5×1010個孢子；每個細菌寬1 μm，長5 μm。保存期限六個月，不適與鹼性物質混合。
(二)	蘇力菌之作用機制：蘇力菌為一胃毒劑，必須讓害蟲取食引起消化道中毒而死，所有蘇力菌產品之作用原理，均與此類似。當蘇力菌孢子及其毒蛋白結晶內毒素被標的害蟲取食，進入中腸，中腸內呈高度鹼性，並含有許多酵素，以致於毒蛋白結晶溶解，會使中腸細胞麻痺，毒蛋白成份隨即攻擊害蟲腸壁，阻斷酵素系統，干擾正常的消化作用，腸壁迅即產生破洞、腸穿孔，而使得腸內的物質進入體腔、血淋巴。此一初步中毒，使得害蟲停止進食，甚至於麻痺，然後細菌孢子經由此腸破洞侵入害蟲體腔及其他組織，在血淋巴內繁殖數小時，引起血淋巴中毒、敗血症，迅速將害蟲殺死或數日後死亡。毛毛蟲如果取食到蘇力菌，可能殘命茍活數日，但中毒之害蟲已無心飲食，所以不會繼續為害。死去之害蟲乾癟成暗色，但仍成90度的吊掛在枝葉上。蘇力菌雖然會在受攻擊之害蟲體內增殖，但幾乎不會再產生孢子或毒蛋白結晶。一般被蘇力菌殺死的害蟲，不會成為新的感染源。因此，與一般殺蟲劑一樣，自然分解消失；如果害蟲孳生源沒有清除，必須多次的施藥。蘇力菌對於標的害蟲以外的生物（尤其是天敵）無毒害。因此，受蘇力菌寄生之害蟲，更容易被其天敵捕食或寄生，進而降低害蟲之密度，更可減少殺蟲劑之使用。
(三)	劑型：蘇力菌可製成液體濃縮劑、可濕性粉劑、粉劑、粒劑或餅塊劑。最近有另添加黏著劑，使其易於覆蓋樹葉表面，增加顆粒密度者，當空間噴灑時，減少揮散、增加美味，以誘引害蟲取食，減少陽光曝露之破壞、增加混合效果等。過去認為蘇力菌對某些害蟲防治無效，劑型改良後，都要從新測試。
(四)	蘇力菌之毒性：依據美國USDA之評估報告，蘇力菌之各種毒性如下：

1.	急性毒：人體口服1,000 mg/day無影響；以6.7×1011 孢子高劑量曝露對鳥、狗、天竺鼠、小鼠、大鼠，甚至於人皆無不良反應。對大鼠之LD50在5,000~13,000 mg/kg。兔子皮膚接觸毒LD50為7,200 mg/kg，但會對眼睛有些微刺激，致眼紅流淚，其實這是物理性的刺激而非生物性的作用。對小鼠進行呼吸實驗，以6.0×1010孢子/公升之呼吸量曝露1小時以上，未發現症狀。
2.	慢性毒：8個人曝露在蘇力菌發酵槽、潮溼的菌餅、廢菌液、甚或純的蘇力菌粉，持續7個月無不良感覺。大鼠以8,400 mg/kg/day劑量之蘇力菌餵飼 13週無影響。以1 mg/kg/day劑量塗敷大鼠皮膚傷口21天，僅發現皮膚發紅，但無任何症狀。
3.	生殖毒：無
4.	突變影響：蘇力菌會使部分植物受傷組織病變，但對取食之哺乳動物無影響。

5.	致癌性：蘇力菌以8,400 mg/kg/day高劑量飼養大鼠兩年，無致癌性。

6.	生態影響：對鳥之LD50超過10,000 mg/kg。蘇力菌噴灑區域，觀察野外74種鳥類，未發現族群有何變化。

7.	對水生物之影響：蘇力菌對魚類實際上無毒。將?魚曝露於560~1,000 mg/L水溶液中96小時，無任何影響，但小蝦（shrimp）、貽貝（mussel）則略有影響。

8.	對其他動物之影響：蘇力菌對大部份有益昆虫無毒無害，對蜜蜂及其生產之蜂蜜無毒害，蜜蜂以每c.c.含有108 個孢子之高劑量蘇力菌糖漿餵飼，並無症狀。此外，蘇力菌對兩棲類之青蛙、爬虫類之蜥蜴均無不良影響。

9.	蘇力菌在環境中之宿命：
	(1)	在土壤及地下水中，蘇力菌為某些害蟲之天然病原菌，但釋入環境中極易於被破壞分解，由於其生物半生週期（biological halflife）很短，且具專一性，所以不會如同化學殺蟲劑一般的對標的害蟲以外的動物造成傷害，標的害蟲也不會對其產生抗藥性。蘇力菌在良好土壤環境中之自然半生期雖為四個月，但當被蘇力菌殺死之害蟲，蘇力菌由蟲屍釋入泥土中，土壤中的pH值在5.1以下，蘇力菌隨即失卻其活性。微生物殺蟲劑在土壤中不移動，也不會被地下水溶滲，不會影響到地下水。
	(2)	在水中之分解：美國環保署並未限制蘇力菌在水體中之使用，足見其安全無慮。蘇力菌在水中可以存活48小時以上，其後逐漸沉澱、安定或黏附於懸浮之有機物上。
	(3)	蘇力菌在植物上之分解：由於陽光紫外線的照射破壞，蘇力菌在植物上快速分解；在正常陽光下，其半生期3.8小時。對植物無毒，不影響其開花，結果或種子發育。

(五)

安全性：蘇力菌於1961年美國核准為一般用殺蟲劑（General use Pesticide,GUP），因其對眼睛皮膚可能有些微刺激作用，故其毒性分類屬第三類-微毒。蘇力菌一般認為對人無害，技術級之純蘇力菌，對老鼠的口服半數致死量LD50為400 mg/kg，但製成劑型，濃度降低則為8,100 mg/kg。通過人體口服毒性試驗，故美國藥物食品檢驗局核准「免於食物殘留量試驗」，蘇力菌可以直接用於食用作物。意即蘇力菌對供試動物，實質上無毒，直接施用於食用作物，對人體無害。在實驗室有一案件，實驗人員不小心將蘇力菌溶液濺入眼睛，結果並無症狀影響，只是產生一些抗體。當蘇力菌孢子吸入呼吸道或擦到皮膚破皮處，身體反應，主要是一些「外來蛋白質」，對於體質比較敏感的個體會造成過敏現象。噴灑蘇力菌施工，只要按一般的個人防護，戴手套、口罩、穿長袖、長褲即可。　

(六)

應用：蘇力菌為蘇力桿菌之無性生殖細胞-孢子，所產生之毒蛋白結晶體，當此孢子被害蟲幼蟲取食後會對標的害蟲殺害，故其為胃毒劑。蘇力菌之防治害蟲一定要被生長發育期之幼蟲取食，才能發揮藥效，蘇力菌對成蟲則無防治效果。由於蘇力菌為一活的微生物，因此，儲存時要避免高溫。理想的話，蘇力菌在使用以前應儲存於冷藏室。儲存於低溫多少可以延長其效期，在21℃至24℃，蘇力菌粉能保存2~3年有效。運輸時要注意陰涼和通風，不要直接曝露於陽光下，在熱天不要裝於密閉的卡車內。
由於儲存的溫度會影響到蘇力菌產品的效力及生存活力，所以購買蘇力菌時，要送貨者認定是新鮮貨品。有些零售送貨者，以凋萎之蘇力菌（在高溫或其他不良環境下儲存，其效價明顯降低）供貨，吾人可檢視包裝上的製造日期，批號作為研判參考。大部份的蘇力菌劑型，以水稀釋噴洒，如為可濕性粉劑加水稀釋時，要一邊添藥，一邊攪拌。稀釋用水，酸鹼度最好是pH：7或略低，使呈弱酸性。如為pH：8之鹼性，將會破壞蘇力菌毒蛋白之結晶，而影響其藥效。幸好，許多產品有緩衝效應，可以減少pH值之不當。藥劑現用現泡，稀釋後12~72 小時，將失去其藥效。

　　由於儲存的溫度會影響到蘇力菌產品的效力及生存活力，所以購買蘇力菌時，要送貨者認定是新鮮貨品。有些零售送貨者，以凋萎之蘇力菌（在高溫或其他不良環境下儲存，其效價明顯降低）供貨，吾人可檢視包裝上的製造日期，批號作為研判參考。大部份的蘇力菌劑型，以水稀釋噴洒，如為可濕性粉劑加水稀釋時，要一邊添藥，一邊攪拌。稀釋用水，酸鹼度最好是pH：7或略低，使呈弱酸性。如為pH：8之鹼性，將會破壞蘇力菌毒蛋白之結晶，而影響其藥效。幸好，許多產品有緩衝效應，可以減少pH值之不當。藥劑現用現泡，稀釋後12~72 小時，將失去其藥效。

三、蘇力菌以色列變種（B. thuringiensis israelensis, Bti）

　　蘇力菌以色列變種最早是由Goldberg與Margalit在1977年，首先自土壤中篩選分離出來，用於蚊蟲幼蟲之防治。蘇力菌過去一般咸認為僅對防治鱗翅目害蟲有效，此後則開創出另一新的市場；1980年代以後，蘇力菌以色列變種迅即為美國各州普遍用為蚊蟲防治。WHO則在非洲推廣用於血絲蟲病媒蚊之防治，但Bti對鱗翅目幼蟲則無效。在免疫學上，Bti毒蛋白結晶含有較其他蘇力菌為多的lysine, threonine, proline, valine, methionine, isoleucine 且含有sugars glucose, mannose, fucose, rhamnose, xylose, galactosamine等成分。

(一)	蘇力菌以色列變種之註冊：Bti係從自然界土壤中篩選出來的桿菌，美國環保署於1983年核准使用於蚊蟲防治。蚊子幼蟲孑孓取食Bti產品（含有活性孢子及毒蛋白結晶）後，毒蛋白結晶之分子會與孑孓中腸細胞的受體鍵結，而破壞其消化道。但此毒蛋白結晶不與哺乳動物（包括人）腸細胞受體鍵結，具高度專一性，故對人畜甚為安全。迄2002年美國EPA已核准26種Bti產品上市。美國EPA在Bti微生物製劑核准前，經歷過無數次的實驗，証實對人體無毒，只要依照標示使用，對人類健康無害，對野生動物，非標的種類，甚或環境均無礙。
(二)	蘇力菌以色列變種之防治對象害蟲：Bti產品用以防治幼蚊孑孓、黑蚋及蕈蚋幼蟲最為有效。Bti對斑蚊屬（Aedes）、Psorophora屬之幼蚊感受性最佳，如用來防治瘧蚊屬（Anopheles），家蚊屬（culex）則需要的劑量要提高。Bti如用來防治蠅類，只適用於黑蚋之水生幼蟲、蕈蚋之 Megaselia屬、Lycoriella屬。Bti對普通家蠅、刺蠅則無效。此可能由於這些蠅類的幼蟲蠅蛆（maggot）孳生於水肥等動物排泄物或高有機質內，而Bti的孢子在此環境之下，迅速分解所致。Bti桿菌經由孑孓取食侵入蟲體，殺死孑孓相當安全，且因其高度的選擇性，只殺死孑孓及某些種水生昆蟲，對環境相當友善。Bti最常施用於幼蚊孑孓孳生之積水處，例如水溝、池塘、水庫、儲水容器、花瓶、水盤、廢容器等之積水處、鹽澤、水田以及黑蚋幼蟲孳生之小溪。水生昆蟲蜉蝣、石蠶、豆娘、蛇蜻蛉、蜻蜓等之稚蟲不會去取食Bti之蛋白結晶，且均不具感受性；而蜻蜓之成蟲、稚蟲均會捕食Bti中毒之孑孓或成蚊，但不具為害性。
(三)	Bti 如何防治蚊子幼蟲：Bti與其他蘇力菌品系一樣，具胃毒作用，當孑孓吃到孢子，可以破壞蚊子幼蟲中腸之細胞（如圖），其殺蟲作用迅速，用以防治家蚊15分鐘後，棲群半數致死，其餘的亦在一小時內死亡，甚至於有的個體於曝露5分鐘內死亡。Ponce等（2002）在墨西哥試驗以Bti取代temephos防治埃及斑蚊幼蟲，其曝露24小時LC50為0.0104 ppm. LC95為0.18 ppm。Dominic等（2000）以Bti之懸浮劑處理熱帶家蚊，其LC50為0.046 mg/L，以1.2 l/ha之劑量2~8天可以達到80 ﹪之防治率。Zaiunin等（2002）利用埃及斑蚊二齡幼蟲孑孓捕食Bti毒蛋白Cry11A及Cry4B，然後以電子顯微鏡超微細觀察孑孓消化道之病理變化，發現中腸之細胞質崩潰瓦解，出現大型之孔隙；微絨毛的數目減少，甚至於被破壞消失殆盡；週圍之滋養膜在中腸管腔內消失。而前腸及後腸的上皮細胞及表皮細胞則無此現象；Cry4B型要優於Cry11A。
(四)	Bti之劑型與應用：Bti常與玉米穗軸製成顆粒劑型，用以防治孳生於樹洞，廢輪胎堆裡或其他方法無法到達之孑孓孳生場所。Bti適用於清澈、寧靜的水域，高濁度及高有機質會降低其藥效。Bti市售產品有Teknar. Bactimos. Vectobac 等品牌，為防治孑孓最低毒且高度選擇性之藥劑。

　　據Robert等（1998）之報告，Bti 孢子及其毒蛋白結晶，可以崁入幼蚊孑孓之食物-原生動物Tetrahymena pyriformis之液胞內，形成穩定的生物膠囊（bioencapsule）。每一隻T.pyriformis細胞於其食物空胞內濃縮有多數的Bti 孢子及其毒蛋白結晶，當幼蚊孑孓取食此原生動物時，即會順便將Bti 及毒蛋白結晶食入，因而迅速死亡。未被取食的原生動物，其食物空胞內未消化的物質，即被細胞排泄消失。因此，生物膠囊的防治幼蚊孑孓效果，取決於食物空胞內Bti 孢子及毒蛋白結晶之排泄時間。
　　Fillinger等（2003）在非洲肯亞以Bti水懸粒劑防治瘧蚊幼蟲，要比粉劑效果顯著。每週施藥一次，足以抑制病媒瘧蚊之再出現。如能與蚊帳泡藥防治成蚊搭配，實施綜合病媒管理(Integrated Pest Management, IPM)，其防治成效更加顯著。
　　Maldonado等（2002）將Bti製成多隅體粒劑，在20~35℃及50~80﹪相對濕度下儲存一年，然後以埃及斑蚊作藥效試驗，觀察曝露 24小時後的死亡率。Bti之LC50與LC90分別為0.016及0.051 mg/L，多隅體劑型儲存8個月，藥效幾乎沒降低。日光紫外線曝露，對照組降低40~46﹪，而實驗組僅稍微有變異。10﹪Bti阿拉伯膠多隅體劑型，施用後14天仍有80﹪之死亡率；動物膠製成者為65﹪死亡率；而以石腊製成者（5﹪）21天有60﹪之死亡率。相對於對照組處理14天後，死亡率僅 2.6﹪，市售產品亦僅37﹪。Srivastava（1999）稱Bti之可濕性粉劑，使用後可迅速殺死幼蚊孑孓，但持效僅21天，緩慢釋散劑型則可持效49天之久，製成懸浮錠劑可持效28天。Prabakaran等（2001）將Bti以藻酸?製成膠囊念珠狀（alginate encapsulated beads），施用後Bti飄浮於水面，從第6~27天，平均孢子釋出率3.04×104 ml/day，孑孓死亡率91~100﹪。28~33天，孢子釋出率1.16×104 ml/day，幼蚊死亡率72.2~88.2﹪。34~40天，孢子釋出率4.97×103 ml/day，幼蚊死亡率42.2~67.2﹪。
　　Gunasekaran等（2002）以Bti防治污水池及化糞池等高污染積水孳生之熱帶家蚊幼蟲。處理區比對照區慢兩週成蚊開始出現。處理30~34天，成蚊減少80﹪以上，因此建議Bti每個月施放一次。
Ibarra等（2003）報告稱，在巴西以Bti防治埃及斑蚊、熱帶家蚊，LBIT 315、348、IB 604等品系之活性要比Bti以色列亞種強三倍之多。
　　Melo-Santos等（2001）利用模擬生態體系，以Bti之緩慢釋散固體錠劑防治埃及斑蚊（Aedes aegypti）之四齡孑孓，曝露48小時後，幼蚊孑孓初死亡率（initial mortality）93-100﹪。生態體系曝露於陽光之下，殘效（孑孓70﹪死亡率）13-35天，但在陰涼遮陰處，殘效延長為40-54天。
　　為了改良Bti，Manasherob等（2001）曾將Bti之基因植入大腸桿菌（Escherichia coli），但成效不彰。次年Manasherob等（2002）再以基因轉移技術將Bti及其delta內毒素蛋白基因轉植入氮固定纖毛藍菌 Anabaena PCC 7120品系，可以防止日光紫外線之破壞。
　　Dennett等（2000）嘗試以Bti添加黃豆油，施用於瘧蚊幼蟲之防治，冀利用黃豆油在水中懸浮性，增加Bti之防治效果，結果不但無增效作用，反而降低防治率。
　　Wirth等（1997）稱Bti雖可取代化學殺蟲劑，選擇性的防治幼蚊孑孓，且為生物可降解之殺蟲劑（biodegradable insecticides），但彼以熱帶家蚊（Culex quinquefasciatus）篩選60代後，發現有抗藥現象，且Bti各品系間有交叉抗藥性產生。

　圖解圖片